양극산화와 순환 석회화전처리하여 개질한 티타늄 메쉬의 이반드로네이트 처리 효과

서론

치조골이 국소적으로 결손된 환자의 임플란트 시술 시는 골량의 증대가 요구되며, 이러한 경우 골이식재와 차폐막을 병용한 골유도재생술이 적용되고 있다(1). 하지만 상기의 방법을 적용하는 경우 구조적인 완전성이 결여되어 있기 때문에 연조직이 압박을 받으면서 일어나는 골이식 재료의 변형이나 위치의 이동이 문제가 되고 있다(2, 3). 차폐막에 대한 초기의 연구에서는 결손된 치조골을 덮어서 연조직의 침투와 외형적인 변형을 막는 것에 주로 관심을 기울였지만(4), 근래에는 결손된 치조제의 증강 및 임플란트 주위골의 재생을 유도하기 위한 목적으로 사용된다(5).

차폐막은 생분해성의 여부에 따라서 비흡수성과 흡수성으로 분류한다. 비흡수성의 차폐막 재료로는 polytetrafluoroethylene (PTFE)계의 수지와 순 티타늄 박판이 널리 사용되고 있다. PTFE 차폐막은 골 결손 공간에서의 혈액 공급이 제한되거나 구강 내에서 노출이 되면 치태가 침착되어 감염을 일으키는 등의 문제점을 보였다. 하지만, 티타늄 메쉬는 혈류공급을 방해하지 않으므로 체액의 교환이 이루어질 수 있고, 소재의 특성상 생체적합성이 우수하므로 노출이 된 경우에도 염증반응이 적고, 세포외기질을 통해 완전한 골유착을 촉진한다. 또한, PTFE 차폐막에 비하여 견고하므로 치유기간 동안에 외형적인 변형을 막을 수 있다는 점에서 주목을 받고 있다(6, 7).

비반응성의 티타늄 표면에 생체활성을 부여하기 위한 초기의 시도에서는 골의 주성분인 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite: HA)와 같은 생체활성 세라믹 재료를 코팅하는 방법이 고려되었다(8). 하지만 이 방법을 적용하는 경우 HA 피막층과 하부 티타늄 기판 사이에서 강한 결합을 얻기가 어렵고, 피막층이 상대적으로 두껍게 형성되어 기저로부터 박리가 일어나는 등의 문제점을 보였다(9, 10). 이러한 이유로 티타늄의 골전도성을 개선하기 위한 최근의 연구에서는 HA를 피복한 것과 유사한 효과를 보이면서도 피막층이 쉽게 손상되지 않는 표면처리 방법에 대하여 관심이 모아지고 있다. 그의 대안적인 방법의 하나로서 불소이온을 함유하는 전해질 용액 중에서 양극산화처리를 하여 나노튜브 구조의 TiO₂ 층을 형성한 후 생체활성 코팅층을 형성하는 순환 석회화전처리 방법에 관심이 집중되어 왔다(11-13). 여러 연구들에서도 나노튜브가 형성된 티타늄 임플란트에 인산칼슘계의 생체활성 물질을 탑재하여 골유착이 촉진되었다고 보고한 바 있다(13, 14).

티타늄 메쉬나 임플란트의 골재생을 향상시키기 위해서는 앞선 연구에서 설명한 나노튜브 TiO₂에 인산칼슘과 생체활성 물질을 탑재하거나 약물을 로딩시킬 수 있는데, 비스포스포네이트계 이반드로네이트(Ibandronate: IB) 약물은 골재생을 개선할 수 있는 대표적인 물질이다. IB는 성숙한 파골세포의 흡수성 활성을 억제시키고, 조골세포의 증식, 분화 및 뼈 형성 활동을 직접적으로 향상시키는 것으로 나타났다(15). 특히, 비스포스포네이트와 함께 인산칼슘의 기능화에 대한 관심이 높아지고 있다. 인산칼슘과 비스포스포네이트의 강한 친화력으로 뼈에 대한 국소 투여에 이상적인 전달 시스템으로 작용하며, 이는 장기적인 약물 투여에 대한 부작용을 방지할 수 있다(16).

이에 본 연구에서는 생체활성을 증가시키고, 골재생을 유도하기 위하여 나노튜브 TiO₂ 층이 형성된 티타늄 메쉬의 표면에 생체활성 물질인 인산칼슘을 석출시키고, IB를 탑재하였다. 표면처리된 티타늄 메쉬의 생체활성도와 IB의 방출 특성에 대하여 조사하였다.

재료 및 방법

1. 시험 시편의 준비

본 연구에서는 두께 100 ㎛ 티타늄 박판에 직경 0.23 ㎜ 홀이 0.19 ㎜ 간격으로 형성되어 있고, 홀들을 연결하는 줄 사이의 간격이 약 0.12 ㎜인 티타늄 메쉬 (TMN35508-S2, Neobiotech, Seoul, Korea)를 10 ㎜ × 10 ㎜ 크기로 절단하여 시험에 사용하였다(Figure 1).

Figure 1.

Titanium mesh used in this study.

2. 표면 처리

1) 나노튜브 TiO₂ 층의 형성

메쉬의 제조과정에서 형성된 표면층의 산화물을 제거하기 위해 HNO₃ : HF : H₂O를 12 : 7 : 81로 혼합한 용액에 준비한 시편을 10초 동안 침지하여 산세처리를 하였고, 이어서 3차 증류수에서 5분간 초음파 세척을 하고 50 ℃ 건조기에서 24시간 건조 후 양극산화처리에 사용하였다. 이후 나노튜브 TiO₂ 층을 형성하기 위하여 DC 정전원장치(Inverter Tech Co, Ltd, Gwangju, Korea)의 양극과 음극에 각각 준비한 시편과 백금판을 결선하고 두 전극을 약 20 ㎜ 떨어지도록 위치시킨 다음 1.5 wt% NH₄F와 20 wt% H₂O를 함유하는 글리세롤 수용액에서 전압 20 V, 전류밀도를 20 ㎃/㎠의 조건에서 1시간 동안 양극산화처리를 하여 나노튜브 TiO₂ 층을 형성하였다. 이후 시편들을 3차 증류수에서 1분간 초음파 세척한 다음 50 ℃ 건조기에서 24시간 건조하였다.

2) 순환 석회화전처리 및 열처리

나노튜브를 형성한 시편을 0.5 vol% 실리카 수용액에 5분 동안 침지한 후 100 ℃에서 1시간 동안 건조하였다. 인산칼슘의 석출을 유도하기 위해 실온에서 0.05 M NH₄H₂PO₄ 수용액과 0.01 M Ca(OH)₂ 수용액을 준비한 후 온도를 90 ℃로 올리고서 침지시간 1분과 외부 유지시간 1분을 주기로 하여 20회 순환 침지처리를 하였다. 이어서 시편들을 전기로(Ajeon Industrial Co, Ltd, Namyang, Korea)에 넣고 승온속도 10 ℃/min으로 500 ℃까지 온도를 올려서 2시간 동안 유지하였다.

3) 이반드로네이트의 탑재처리

이반드로네이트는 피하주사용으로 제공되는 1 vial Unibone (Unimed Pharm, Seoul, Korea) 3 ㎖를 3등분하여 이반드론산나트륨일수화물(Figure 2)이 1.125 ㎎/㎖ 농도로 희석된 용액을 탑재처리에 사용하였다.

Figure 2.

Chemical structure of ibandronate sodium monohydrate (adapted from Russell R., et al(17)).

시편들을 각각 준비한 용액 1 ㎖에 10분 동안 침지하고 질소가스로 동결 건조하는 방식으로 3회 반복하였다. 시편을 용액에 침지하는 동안 -0.05 MPa의 음압을 가하였다.

표면 처리에 따른 네 가지 유형의 그룹을 Table 1에 요약하였다.

Table 1.

Ti mesh samples (4 groups) used in this study

결과

1. 표면 특성

NT 그룹(Figure 3a, d)의 표면에서는, 나노튜브들이 큰 직경의 튜브들 사이에 작은 직경의 튜브들이 생성되는 형태로 치밀한 구조를 이루면서 자가 정렬되는 양상을 보였다. NTCP 그룹(Figure 3b, e)의 표면에서는, 미세한 알갱이 상의 인산칼슘 석출물들이 덩어리(cluster)를 이루며 치밀하게 석출이 되었으며, EDS 분석 결과에서도 Ca와 P가 크게 증가되었다(Table 2). NTCPI 그룹(Figure 3c, f)은 인산칼슘 석출물들이 NTCP 그룹에 비하여 소량 감소된 양상을 보였으나 표면에 고르게 분포하고 있었으며, EDS 분석 결과에서도 Ca와 P가 거의 유사하게 검출되었다(Table 2).

Figure 3.

HR FE-SEM images of the NT (a, d), the NTCP (b, e), and the NTCPI groups (e, f).

Table 2.

EDS analysis results of the surface-treated groups

그룹들의 표면에서 검출된 원소들은 Non 그룹에서는 Ti 피크만이 관찰되었고, NT 그룹에서는 Ti 피크와 함께 TiO₂ 피크가 관찰되었다. NTCP와 NTCPI 그룹들에서는 이들 피크 이외에도 옥타칼슘포스페이트(OCP), HA의 주 피크가 함께 관찰되었다(Figure 4).

Figure 4.

XRD patterns of the surface-treated groups. Meaning of symbols: ★: Hydroxyapatite, ○: Octacalcium phosphate, ◆: TiO2, □: Ti

2. 생체 외 방출

IB가 탑재된 NTCPI 그룹에서는 첫째날에 0.108 mg/cm²/mL가 방출되었고, 그 후 급격하게 감소하였지만 10일째까지 지속 방출되었다(Figure 5).

Figure 5.

In vitro release of an ibandronate-loaded the NTCPI group for 10 days.

3. 유사체액 침지

SBF에 10일간 침적한 결과 NT (Figure 6a, d), NTCP (Figure 6b, e) 및 NTCPI 그룹(Figure 6c, f)에서 HA 석출 시 관찰되는 돌기상들이 치밀한 구조로 석출되었고, EDS 분석 결과 SBF 침적 전(Table 2)과 비교하여 Ca와 P의 함량이 증가하였다(Table 3). 특히, NTCP와 NTCPI 그룹에서는 돌기상들이 두께방향으로 중첩이 되며 성장하는 양상을 보였고(Figure 6), Ca/P의 함량이 크게 증가하였음을 확인하였다(Table 3).

Figure 6.

HR FE-SEM images of the NT (a, d), the NTCP (b, e), and the NTCPI groups (c, f) after immersion in SBF for 10 days.

Table 3.

EDS analysis results of the surface-treated groups after immersion in SBF for 10 days

Ti, TiO₂ 피크만 관찰되던 NT 그룹의 표면에서는 SBF에 침적한 후 HA와 octacalcium phosphate 피크가 관찰되었다. NTCP 및 NTCPI 그룹들에서는 SBF 침적 전과 비교하여 HA 상의 침전 증가가 관찰되었다(Figure 7).

Figure 7.

XRD patterns of the surface-treated groups after immersion in SBF for 10 days. Meaning of symbols: ★: Hydroxyapatite, ○: Octacalcium phosphate, ◆: TiO2, □: Ti

고찰

임플란트 수술의 장기적인 성공을 위해서는 잠재적 임플란트 이식 부위에 충분한 양과 질의 치조골이 있어야 한다. 해결 방법으로 골이식재와 차폐막을 병용한 골유도재생술이 시행되고 있지만, 차폐막의 종류에 따라서 강성이 부족하여 붕괴되거나, 연조직의 성장을 차단하지 못하여 조기 흡수가 발생하는 경우가 있다(18).

다양한 연구에 따르면 티타늄 메쉬는 e-PTFE계 막이나 흡수성 막보다 신생 치조골의 공간을 예측 가능하게 유지하고, 붕괴에 저항력이 높다고 알려져 있다(19, 20). 또한, 뼈 재생에 티타늄 메쉬를 사용하면 상피 세포와 섬유아세포가 결함으로 이동하는 것을 방지하고, 이는 골조상(osteoprogenitor) 세포가 해당 부위에 도달하여 새로운 뼈를 재생성하도록 돕는다(21). 하지만, 티타늄은 생체 불활성 물질로 간주되어서 표면적을 증가시키는 나노기술을 적용하고, HA, 바이오글라스 및 글라스-세라믹과 같은 생체활성물질을 코팅하거나 골형성을 유도하는 약물 등을 담지해야 골전도성을 갖게 된다(22).

나노 튜브가 형성된 표면은 표면에너지의 증가, 생체 적합성 및 시험관 내 표면에 대한 조골 세포 접착력에 영향을 미친다(23). 본 연구에서는 티타늄 메쉬에 양극산화처리로 균일하게 자가 정렬된 나노튜브 TiO₂ 층을 형성하였고(Figure 3a, d), SBF에 침지하여 생체 활성을 평가하였다. 그 결과 표면에 HA 침전물이 형성되었고(Figure 6), 칼슘과 인산 이온이 검출되었다(Table 3). 이는 형성된 나노튜브 TiO₂ 층이 SBF와 상호작용하여 HA의 핵생성과 SBF에서 칼슘과 인산 이온을 흡수하여 자발적으로 HA의 형성이 발생한다는 문헌의 결과와 일치한다(24).

이온 주입, 알칼리처리, 플라즈마 스프레이 코팅 및 순환 석회화전처리와 같은 표면 개질 기술은 티타늄 표면의 화학적 조성, 거칠기 및 형태를 변화시킴으로써 티타늄의 생체 활성을 효과적으로 향상시킨다(25). 그 중 순환 석회화전처리는 칼슘과 인산염 이온이 함유된 수용액과 티타늄 표면의 TiO₂ 사이의 산-염기 반응을 유도하는 방법이다(26). NTCP와 NTCPI 그룹을 SBF에 침지하였을 때 단기간에 HA 돌기상이 치밀한 구조를 이루며 두께방향으로 성장하였고(Figure 6), X-선 회절분석 결과 이들은 HA와 OCP로 확인되어 생체활성도가 개선되었음을 알 수 있었다(Figure 7). 나노 구조 표면과 적절한 결정상 및 생체 활성 HA의 조합은 티타늄 메쉬의 생체 활성 및 생체 적합성을 향상시킬 수 있으며 이는 골유착을 향상시킬 수 있음을 시사합니다(27).

IB는 파골세포의 기능을 억제하는 비스포스포네이트계의 약물로서 파골세포 내 세포골격이 파괴되며 골 흡수의 기능을 상실시킨다. 또한, 인산칼슘과 결합된 IB의 지속 방출은 파골세포 전구체의 모집 및 분화 억제, 성숙한 파골세포에 의한 재흡수 억제, 성숙한 파골세포의 세포사멸을 촉진하여, 강력하게 골의 흡수를 억제한다(28). 본 연구에서는 나노튜브 TiO₂ 층이 형성된 티타늄 메쉬에 인산칼슘을 석출시킨 후 IB를 담지하였고, 골재생 유도를 위한 생체활성도를 조사하였다. 그 결과, 10일이 경과할 때까지 티타늄 메쉬에서 IB가 지속해서 방출되었고(Figure 5), 파골세포의 기능 억제와 조골세포의 증식, 분화 및 뼈 형성 활동에 기여할 수 있을 것으로 생각된다. IB의 분자는 2개의 공유결합 곁사슬로 R1과 R2 치환기를 갖고 있어서 R1 치환기의 -OH는 칼슘과 결합하고, R2 치환기의 질소는 HA의 하이드록실기와 결합하여 N-H-O 수소 결합을 형성한다(17)(Figure 2). 여러 연구들에서 티타늄 상에 인산칼슘을 코팅하고, 비스포스포네이트계 약물을 흡착하는 방법으로 골형성 효과에 대해서 뒷받침하고 있다. 문헌에 따르면 HA가 코팅된 티타늄 임플란트에 IB를 국소적으로 적용하여 초기 골 형성 비율을 증가시키는 것으로 알려졌다(29). Gao 등(30)은 HA로 코팅된 티타늄 임플란트에 IB 용액을 침지한 후 난소절제술을 받은 쥐의 경골에 삽입하였다. 3개월 후 처리된 임플란트 주위의 골밀도가 증가하였고, 신생골의 형성도 증가하였다는 연구 결과를 얻었다. 또한, Niu 등(31)은 비스포스포네이트-HA 복합 코팅된 임플란트에서 첫 주 동안 방출된 비스포스포네이트는 파골세포 활성을 억제하였고, 나머지는 11주 동안 점진적으로 방출되면서 임플란트 주위의 지속적인 저농도의 약물을 보장하고 임플란트 주위 골 형성에 도움을 주었다고 하였다.

양극산화처리를 하여 나노튜브 구조의 TiO₂ 층을 형성하고, 인산칼슘 코팅층과 결합한 골형성 유도 약물로(이반드로네이트) 처리된 티타늄 메쉬의 생체 활성이 증가하였음을 확인하였고, 앞선 연구들의 결과를 미루어 볼 때 임플란트 매식부의 골재생을 유도하는데 있어서 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 생각된다. 그러나 본 연구에는 몇 가지 한계점이 있다. 첫째, 한 가지의 약물 탑재 조건에서만 실험하였으나, 후속 연구를 통해 탑재되는 약물의 양을 늘리고 방출을 조절하기 위한 추가적인 노력이 필요하다. 둘째, 약물의 원리와 효과를 입증할 수 있는 시험관 내 및 생체 내 분석이 필요하다.

결론

본 연구에서는 티타늄 메쉬의 생체 불활성을 개선하고자 나노튜브 구조의 TiO₂ 층을 형성하였고, 생체활성 물질인 인산칼슘을 코팅한 후 이반드로네이트를 탑재하여 결합하였다. 생체활성을 향상시켰다는 결과로 SBF 용액에 침지된 NTCPI 그룹의 표면에는 수산화인회석이 균일하게 분포되어 있었으며, 시간이 지남에 따라 칼슘과 인의 함량도 증가하였다. 10일 동안 지속해서 방출된 이반드로네이트는 생체적합성을 높이고, 골과 티타늄 메쉬의 골융합을 강화하는 메커니즘을 실현하는 데 도움이 될 수 있다. 또한, 연구에 사용된 인산칼슘 코팅 방법은 약물 전달 시스템 분야에 유용하게 이용될 수 있다.

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