티타늄 상에 전기화학적 증착 방법을 이용한 콜라겐 함유 수산화인회석 코팅 연구

서 론

티타늄과 티타늄 합금은 우수한 기계적 성질, 높은 부식 저항성, 뛰어난 생체 적합성(biocompatibility)과 골융합(osteointegration) 특성을 가지고 있어 치과와 정형외과의 임플란트 재료로 가장 널리 상용되고 있다(1, 2). 그러나 티타늄은 생체불활성(bioinert)재료로서, 생체 내에서 부정적인 조직 반응이 일어나지 않지만, 표면에서 골 성장을 직접 유도하지 않기 때문에 상당한 치료 기간이 요구된다. 따라서 티타늄 표면의 직접적인 변형을 통해 골과의 결합뿐만 아니라 생물학적인 특성을 향상시키려는 많은 연구들이 진행되고 있다(3). 티타늄 표면 코팅에 사용되는 재료에는 여러 가지 종류들이 존재하지만, 본 연구에서는 골과 유사하게 콜라겐(Type-I)과 수산화인회석(hydroxyapatite;HAp, Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂)을 코팅 재료로 사용고자 하였다(4).

Type-1 콜라겐은 HAp와 함께 경조직을 구성하는 주된 단백질 중 하나로써 콜라겐을 코팅한 티타늄 임플란트에 대한 연구들이 보고되어 왔다(5). 쥐의 경골 모델을 이용한 연구에서 콜라겐을 코팅한 티타늄 핀은 골의 재형성(bone remodeling)을 향상시켰으며 토끼의 대퇴골, 개의 하악, 염소의 대퇴골을 이용한 실험에서 표면을 콜라겐으로 코팅한 티타늄 임플란트는 뼈의 성장과 뼈와 임플란트 사이의 결합을 크게 증가시켰다(6-10).

HAp 또한 우수한 생체 활성 능력(bioactivity)과 생체 적합성을 가지고 있어 임상의학에서 뼈와 치아 임플란트를 위한 필수적인 바이오 세라믹 재료로 사용되고 있다(11-13). 임플란트 표면에 코팅된 HAp는 연조직 또는 경조직과 화학적 결합을 하게 되고 임플란트 표면에 조골세포가 좀 더 잘 부착될 수 있도록 도와주며 조골세포의 생장을 촉진시킨다(14-16).

HAp를 코팅하는 방법으로는 플라즈마 스프레이(plasma spraying)(17), 솔-겔 방법(sol-gel)(18), 열수처리 방법(hydrothermal process)(19), 마이크로 아크 산화 방법(micro arc oxidation)(20-23) 등 여러 가지가 존재한다. 이 방법들의 경우 결정성 HAp를 형성시키기 위해서는 고온 열처리가 동반되어 수행된다. 반면 전기화학적 증착 방법(Electrochemical deposition; ECD)을 통한 HAp 코팅은 코팅 장비와 과정이 간단하며 처리 비용이 저렴하다. 또한 전해질의 성분과 전기적 조건에 따라 코팅된 표면의 두께를 조절하거나 코팅 물질의 조성 또는 미세 구조에 변화를 다양하게 줄 수 있다(24). 대부분의 HAp를 코팅하는 방법들은 고온처리 과정을 거치기 때문에 콜라겐과 같은 유기물을 함께 코팅하기에는 한계가 있다. 그러나 본 연구에서 적용하고자 하는 ECD 방법(25)을 이용한 코팅은 낮은 온도에서 진행할 수 있기 때문에 고온에서 단백질이 변성되는 것을 막을 수 있으며, 체액에서 용해도가 낮은 결정화된 형태의 결정들을 얻을 수 있게 된다. 박등은 ECD 방법을 이용하여 티타늄 상에 소혈청알부민이 함유된 수산화인회석 코팅 방법에 대하여 보고한 바있다(26).

본 연구에서는 티타늄 임플란트 식립 시 조골세포가 더 잘 부착되고 세포의 성장을 촉진 시킬 수 있도록 골과 유사한 형태(biomimetic)로 만드는 코팅 방법을 연구하였다. ECD 방법을 이용하여 골의 주성분인 콜라겐과 HAp를 생체 온도와 비슷한 환경에서 코팅을 진행하였다. 코팅 과정 중 전해질의 종류와 인가되는 전류의 양의 따라 생성되는 박막의 형상과 결정 구조 및 화학적 특성을 규명하고 박막에 형성된 HAp와 콜라겐이 세포의 성장에 어떻게 영향을 주는지에 대해 연구하고자 하였다.

재료 및 방법

3. ECD 방법을 이용한 시편의 표면처리

ECD 방법을 위한 전해질은 증류수 1 L에 1.18 g의 Ca(NO₃)₂ (Junsei Chemical, Tokyo, Japan)와 0.23 g의 NH₄H₂PO₄ (Shinyo Koeki, Kobe, Japan)를 용해시켜 제조하였고 이를 E 용액으로 명명하였다. 동일한 E 용액을 1개 더 제조한 후 이 용액에는 콜라겐 (Collagen Type-I, Corning, USA) 0.2 mg/mL을 첨가하여 이를 ECol 용액으로 명명하였다. 마그네틱 교반기 위에 항온수조를 놓고 준비된 전해질을 항온수조에 채운 다음, 음극에 티타늄 시편을 연결하고 양극에 백금선재를 연결하였다. 시편에 1초동안 전류를 인가하고 다시 1초동안 휴지기를 가졌다. 이와같은 전기적 자극를 총 1500 cycle 또는 3000 cycle을 인가하였다. 전류 값은 -5, -10, -15 mA로 변화시켰으며, 정전류 전원 장치를 사용하였다. 시편을 처리하는 동안 전해질 용액의 온도는 37 ℃를 유지하였다. 위 실험 조건에 따라 Table 1과 같이 시편군들을 준비하였다.

Table 1.

Specimen groups prepared by changing electric current and adding collagen

결과 및 고찰

1. 코팅한 시편의 표면 형상 분석

Ti-As 시편군에 ECD 방법으로 코팅한 각각의 시편들을 SEM을 통해 관찰하였다(Figure 1). 콜라겐이 함유되지 않은 전해질을 이용하여 증착한 Ti-As-E-5, Ti-As-E-10, Ti-As-E-15 시편군에서는 티타늄 표면 위에 화합물 층이 형성되었다. 이 시편들의 고분해능 SEM 이미지를 통해 나노막대형 결정들이 서로 얽혀 층을 형성하고 있는 것이 관찰되었다. Ti-As-E-5 군의 경우 긴 막대 형태의 나노 결정들로 코팅되었으며, 인가된 전류가 증가할수록 막대 모형의 결정들이 점점 짧아지는 양상을 보였다(Figure 1a).

Figure 1.

SEM images of (a) Ti-As-E-5, Ti-As-E-10, Ti-As-E-15, and (b) Ti-As-ECol-5, Ti-As-ECol-10, Ti-As-ECol-15 groups.

콜라겐을 첨가한 ECol 전해질을 이용하여 코팅한 시편 (Ti-As-ECol) 또한 화합물 층이 형성되었다. 그러나 Ti-As-E 시편군들에 비하여 일부 영역이 불균일하게 코팅된 영역들이 관찰되었다. 고배율의 이미지를 통해 Figure 1a의 결정들보다 더 굵은 형태의 결정들이 형성된 것을 관찰할 수 있었으며, E 용액을 사용할 때와 같이 인가되는 전류가 증가함에 따라 나노 결정의 크기가 점점 짧아지는 경향을 보였다. Ti-As-ECol-5 군의 경우 결정 입자가 굵고 긴 막대 모양으로 이루진 반면, Ti-As-ECol-10와 Ti-As-ECol-15군의 경우에는 짧은 막대 모양 또는 과립상과 같은 결정이 관찰되었다 (Figure 1b).

이와 같이 SEM 이미지를 통해서 ECD 처리 과정에서의 전류의 변화와 전해질 내에 유기물인 콜라겐의 함유에 따라 형성되는 나노 결정들의 형태가 달라진다는 것을 알 수 있다.

티타늄 금속에 음극 전류가 인가되면 물분자들이 전자를 만나 수산기(OH^-)가 생성되면서 pH가 올라간다. 또한 수산기와 함께 HPO₄^2- 또는 PO₄^3-이온들도 동시에 생성되며, 이들은 전해질 내의 Ca²⁺ 이온들과 결합하여 인산칼슘 화합물들을 형성한다(28, 29). 티타늄 시편에 인가되는 음극 전류의 세기가 커지면 생성되는 수산기의 양이 많아질 것이며, 이것은 티타늄 주변의 전해질의 pH 값을 변화시킬 것이다. 따라서 이온의 농도가 높아짐에 따라 형성되는 인산칼슘 화합물의 양이 증가할 수 있을 것이며, pH 값의 변화가 형성되는 수산화인회석의 결정형상에 영향을 준 것으로 해석된다.

2. 코팅한 시편의 결정 구조 분석

Ti-As 시편들을 코팅한 나노 결정들의 결정구조는 XRD를 이용하여 분석하였다. 시편 모두에서 기저금속에 해당하는 Ti 금속 피크가 35°, 38°, 40°에서 관찰되었으며 Ti-As-E 시편군에서는 HAp에 해당하는 피크인 25°, 31°, 32°에서 피크가 관찰되었다. SEM 이미지를 통해 알 수 있듯이 결정들이 나노 형태를 이루고 있으며 결정성이 낮기 때문에 (211), (112), (300) 결정면에 해당하는 피크들의 반치폭이 커서 겹쳐진 형상을 보여주었다. 반면에 콜라겐을 첨가한 전해질을 사용한 Ti-As-ECol 시편군들의 경우 Ca-P 화합물과 관련된 XRD 패턴을 관측할 수 없었다(Figure 2). 이 시편군의 SEM 이미지(Figure 1b)에서는 결정들이 박막을 형성하고 있는 것으로 관찰되었지만, 관련된 XRD 패턴을 관찰할 수 없는 것은 박막을 이루는 결정들이 비정질과 같은 낮은 결정성을 갖기 때문으로 여겨진다.

Figure 2.

X-ray diffraction patterns of the specimen groups.

Figure 3는 Ti-As-E-5와 Ti-As-ECol-5 시편군에 대한 TEM 이미지와 SAED 패턴을 나타낸 것이다. Ti-As-E-5군의 경우 침상형의 결정형상를 보여준 반면, Ti-As-ECol-5군의 경우 막대형의 결정형상을 보여주고 있다. 이와 같이 콜라겐 유무에 따라 결정형상은 다르지만 SAED 패턴을 통해 두 시편 모두 HAp 결정구조를 가지고 있는 것을 확인하였다. SAED 패턴이 링패턴으로 관찰된 것은 다결정으로 형성되었기 때문이다. 따라서 콜라겐의 함유가 수산화인회석 형성에는 영향을 미치지 않지만 결정형상에는 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

Figure 3.

TEM images and SAED patterns of Ti-As-E-5 and

콜라겐은 표면에 COO^-와 NH₃⁺ 기능기를 가지고 있어서 Ca²⁺ 양이온과 HPO₄^2- 음이온과 각각 결합을 할 수 있다. 따라서 티타늄 표면에 전류가 인가되기 전에 콜라겐은 전해질 내에 있는 칼슘과 인산 이온들과 결합을 하고 있을 것이다. 이것은 콜라겐이 없는 전해질 용액내에서의 칼슘과 인산 이온들의 농도와 큰 차이를 보일 것이다. 따라서 콜라겐이 함유된 전해질 용액내에서 이러한 유기물들의 영향으로 HAp 결정들이 낮은 결정성을 보이며, 전체적으로 결정 형상에 큰 영향을 미친 것으로 해석된다. 또한 높은 전류에서는 앞서 콜라겐이 없는 전해질에서의 HAp 형성 기전과 유사한 환경에 의하여 전류의 세기에 따른 결정의 형상의 변화를 가져온 것으로 보인다.

3. 코팅한 시편의 화학적 특성 분석

연마 후 에칭 처리를 마친 티타늄 시편(Ti-As)에 ECol 전해질로 사용하여 코팅한 시편들의 표면을 FT-IR 스펙트럼을 통해 분석하였다. 558 cm^-1, 600 cm^-1, 1000 cm^-1에서 관찰되는 피크는 HAp에 기인하는 PO₄^3- 피크들이며, 1642 cm^-1, 1542 cm^-1에서 관찰되는 피크는 콜라겐에 해당하는 피크이다. Ti-As-ECol 모든 군에서 PO₄^3- 피크와 콜라겐 피크가 관찰 되었으며, 그 중 Ti-As-ECol-5 군에서 PO₄^3-피크가 가장 크게 나타났다. 1420 cm^-1에서 관찰된 피크는 CO₃^-에 해당하는 피크이며 형성된 아파타이트의 구조가 골과 유사한 카보네이트 아파타이트(carbonate apatite)에 해당하는 것을 보여준다. 따라서 콜라겐이 함유된 HAp 결정들이 티타늄 표면에 코팅되어 골과 유사한 구조로 형성되었다는 것을 알 수 있다(Figure 4).

Figure 4.

FT-IR spectra of Ti-As-ECol- 5/10/15 groups.

4. 양극산화 처리 후 코팅한 시편의 표면 형상 분석

티타늄 표면에 세포가 더 잘 부착되고 표면적을 넓히기 위해 양극산화와 산처리를 통해 거친 표면을 갖는 Ti-R 군 상에 ECD 방법으로 HAp와 콜라겐을 코팅하였다. 코팅한 각각의 시편들을 ×500와 ×50K의 배율로 SEM을 통해 관찰하였다(Figure 5). Ti-R 군에 E 전해질을 사용하여 코팅하였을 때, 인가되는 전류량이 증가함에 따라 Ti-R 시편의 거친 표면이 점점 사라졌다. 또한 Ti-As 군에 E 전해질을 사용하여 코팅하였을 때와 동일하게 인가된 전류량이 증가할수록 나노 결정 막대의 길이가 조금씩 짧아졌다(Figure 5a). ECol 전해질을 이용하여 Ti-R 군을 코팅한 경우 저배율의 이미지에서는 전류량의 차이에 따른 영향을 확인할 수 없었으나 고배율의 이미지에서는 전류량이 증가함에 따라 나노 결정의 길이가 짧아지는 양상을 보였다(Figure 5b). Ti-R 시편군에서도 표면의 거친 형상을 유지한 상태로 전해질의 종류와 인가된 전류량의 차이에 따른 Ti-As 군의 코팅과 유사한 형상 변화를 확인하였다.

Figure 5.

SEM images of (a) Ti-R-E-5, Ti-R-E-10, Ti-R-E-15, and (b) Ti-R-ECol-5, Ti-R-ECol-10, Ti-R-ECol-15 groups.

5. 양극산화 처리 후 코팅한 시편의 결정구조 분석

Ti-R에 코팅한 시편들 또한 XRD를 통해 결정을 분석하였다. 양극산화 처리 후 E 전해질로 코팅한 Ti-R-E 시편 군에서도 HAp에 해당하는 피크인 25°, 31°, 32°에서 피크가 관찰되었으며 인가된 전류 값이 증가함에 따라 나노 구조의 결정성이 떨어졌다. Ti-As군에 ECol 전해질로 코팅한 실험과 동일하게 양극산화 처리 후 ECol로 코팅한 시편군에서도 HAp의 피크는 관찰되지 않았다. 이를 통해 양극산화를 이용하여 티타늄 표면의 거칠기를 증가시킨 시편들 또한 Ti-As 시편들과 동일한 나노 구조의 HAp가 코팅 되었다는 것을 알 수 있다(Figure 6).

Figure 6.

X-ray diffraction patterns of Ti-R-E-5/10/15 and Ti-RECol-5/10/15 groups.

6. 양극산화 처리 후 코팅한 시편 표면의 화학적 분석

Ti-R-ECol 시편군에 대한 FT-IR 스펙트럼(Figure 8)을 분석하였다. Ti-As 시편들과 비교하였을 때 전체적으로 피크의 세기가 약하게 나타났지만 HAp에 해당하는 PO₄, 콜라겐에 기인하는 amide, 그리고 cabrboante에 기인한 피크들이 관찰되고 있다. Ti-R-ECol-5 시편이 다른 시편에 비하여 피크의 세기가 더 강하여, 약한 전류의 인가하에서 코팅이 더 효율적으로 이루진 것으로 추측된다.

Figure 7.

FT-IR spectra of Ti-R-ECol-5, Ti-R-ECol-10, and Ti-RECol-15 groups.

향후 본 시편들에 대한 골전도성을 평가하고자 생물학적 특성을 연구할 경우, 상기와 같은 HAp 결정구조 또는 결정성의 차이는 골아세포의 특성에 영향을 미칠 수 있으며, 또한 생체에 삽입되었을 때 생체용액에 의한 용해도에 차이를 나타냄으로써, 골 성장에 영향을 미칠 것으로 예측된다.

7. 코팅한 시편 표면의 거칠기 분석

Figure 8은 Ti-As-E-5, Ti-As-ECol-5, Ti-R-E-5, Ti-R-ECol-5 시편군의 3D optical profiler를 이용하여 측정한 이미지이며, 이 이미지들로부터 계산된 표면 거칠기 값을 Table 2에 나타내었다. 단순 연마처리 후 코팅한 Ti-As 군에 비하여 양극산화 처리를 이용하여 거칠기를 부여한 후 코팅한 Ti-R 군은 전체적으로 R_a 값이 크게 나타났다. Ti-As 군에서 E 또는 ECol 전해질을 사용하여 코팅한 시편들의 R_a 값은 코팅을 하지 않은 시편보다 거칠기 값이 더 높았다. 양극 산화를 통해 거칠기가 증가한 Ti-R 시편 군에서는 E 또는 ECol 전해질을 사용하여 시편을 코팅한 후에도 높은 거칠기 값이 유지되었다.

Figure 8.

3D optical profiler images of (a) Ti-As, (b) Ti-As-E-5, (c) Ti-As-ECol-5, (d) Ti-R, (e) Ti-R-E-5, and (f) Ti-R-ECol-5 groups.

Table 2.

Surface roughness values of Ti-As, Ti-As-E-5, Ti-As-ECol-5, Ti-R, Ti-R-E-5, and Ti-R-ECol-5 groups

결 론

본 연구에서는 콜라겐과 Ca, P 이온이 함유된 전해질을 이용하여 ECD 방법을 통해 티타늄 표면 개질 방법을 연구하였다. 코팅된 시편들의 표면 형상, 결정 구조, 화학적 특성을 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

• 1. 각 시편들의 표면 형상을 관찰한 결과, 시편들의 표면에 나노막대 형태의 결정들이 균일하게 형성된 것을 관찰할 수 있었으며, 인가된 전류 값이 증가할수록 나노막대의 길이는 더 짧아졌다.
• 2. XRD 분석 결과 Ti-As-E 시편상에 저결정성 HAp 나노막대가 코팅 되었음을 확인하였으며, TEM 분석으로부터 Ti-As-ECol 시편 상에 코팅된 화합물들 또한 HAp 결정 구조를 갖는 것을 확인하였다.
• 3. FT-IR을 이용한 화학적 특성을 분석한 결과, Ti-As-ECol 시편들에서 콜라겐에 기인한 amide 피크가 관찰되었으며, 이들은 모두 carbonate apatite 구조를 가지고 있었다.
• 4. 거친 표면을 갖는 Ti-R-E과 Ti-R-ECol 시편군에서도 시편의 거친 형상이 유지되면서 Ti-As 시편에서와 유사하게 HAp 결정들이 코팅되었다.

본 연구를 통해 티타늄 상에 ECD 방법을 이용하여 HAp와 Col이 함께 결합된 생체모사형 코팅을 수행하였다. 이 연구결과는 향후 골아세포를 이용한 실험을 통하여 골전도성을 평가하고, 티타늄 임플란트의 생체모사형 표면처리 방법을 개발하는데 적용될 수 있을 것으로 기대된다.

Acknowledgments

This work was supported by the National Research Foundation of Korea (NRF) grant funded by the Korea government (MSIT) (No. 2019R1A5A2027521).

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