탈수열처리를 이용한 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 향상된 생체활성 및 구조적 안정성

서 론

뼈나 연골과 같은 경조직의 대체 및 재생은 생체적합성과 기계적 안정성을 동시에 충족해야 하는 고도의 조직공학적 과제이다(1). 특히, 광범위한 결손 부위의 재생을 위해서는 세포 부착, 증식 및 분화를 유도할 수 있는 3차원 다공성 스캐폴드의 개발이 필수적이며(2), 이러한 스캐폴드는 조직 특이적 미세환경을 모방하여 세포외기질 형성을 촉진해야 한다(3). 스캐폴드는 생리학적 조건에서 적절한 강도, 기공 구조 및 표면 활성기를 가져야 하며, 세포 침투, 혈관화, 그리고 새로운 조직 형성의 초기 단계를 안정적으로 유지할 수 있어야 한다(4, 5).

이러한 요구 조건을 충족하기 위한 천연 고분자 중 젤라틴은 콜라겐으로부터 유래된 생체고분자로, 우수한 생체적합성, 낮은 면역원성, 그리고 적절한 분해성 덕분에 조직공학 및 약물전달 시스템에서 널리 활용되고 있다(6, 7). 그러나 젤라틴은 수용액에서 열적 불안정성, 낮은 기계적 강도, 그리고 빠른 분해 속도와 같은 단점을 가지고 있어, 단독 사용 시 구조적 안정성을 확보하기 어렵다(8). 따라서 젤라틴의 분자 간 상호작용을 강화하여 안정화시키는 가교 과정이 필요하며, 이를 통해 물리적·화학적 강도 및 생체 내 내구성을 개선할 수 있다(9).

기존 연구에서는 젤라틴 가교를 위해 다양한 물리적, 화학적, 천연 기반 가교제가 사용되어 왔다. 물리적 방법으로는 탈수열 처리, 자외선, 감마선 조사 등이 있으며, 이 중 탈수열 처리는 고온, 진공 조건에서 결합수의 제거와 에스테르화 반응을 유도해 젤라틴의 안정성을 향상시키는 대표적인 공정이다(10, 11). 화학적 가교제에는 글루타르알데히드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드 등이 있으며, 이들은 강력한 공유결합을 형성하지만, 잔류 독성 및 세포 독성의 위험이 존재한다(12, 13). 천연 가교제로는 식물 유래 이리도이드 화합물인 제니핀(Genipin)이 대표적이며, 세포 독성이 낮고 생체 내 안정성이 우수하다는 장점을 가진다(14).

최근 약 10년 동안 젤라틴 기반 골조직공학 스캐폴드는 하이드로젤, 다공성 스펀지, 3D 프린팅 구조체 등 다양한 형태로 개발되어 왔으며, 사용되는 가교 방식과 무기질 조성에 따라 기계적 특성과 생체반응이 크게 달라지는 것으로 보고되고 있다(6, 15-17). 특히 젤라틴-하이드록시아파타이트(HA) 또는 젤라틴-칼슘인산염(CaP) 복합체의 경우, 글루타르알데히드, EDC/NHS, 효소적 가교(예: 트랜스글루타미나제) 및 제니핀과 같은 화학·효소적 가교제를 병행하여 열적·기계적 안정성을 확보하는 전략이 주로 사용되고 있다(14, 16, 18). 이러한 복합체들은 in vitro 세포 부착 및 분화 촉진, in vivo 골결손 모델에서의 골형성 증가 등 유의한 효과를 보여 왔으나, 가교제 잔류에 따른 독성 가능성과 공정 복잡성, 가교 균일성 확보의 어려움이 여전히 한계로 지적되고 있다(8, 12, 13, 19, 20). 따라서 젤라틴 기반 스캐폴드에서 화학적 가교제를 줄이거나 배제하면서도 충분한 구조적 안정성과 생체활성을 동시에 확보할 수 있는 단순한 제조 공정에 대한 요구가 커지고 있다.

한편, 골조직 재생에 적용 가능한 스캐폴드는 생체적합성뿐만 아니라 무기질화를 통한 생체활성 확보가 필수적이다(21). 제 8인산칼슘(octacalcium phosphate; OCP)는 생체 내에서 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite; HA)로 전환되는 전구체로 알려져 있으며, 그 과정에서 Ca²⁺ 및 PO₄^3- 이온을 지속적으로 방출하여 뼈 재형성과 무기질화를 촉진한다(22, 23). OCP의 결정 구조는 HA보다 용해도가 높고, 초기 골 형성 과정에서 미세환경 내 이온 농도를 조절할 수 있어 골전도성 및 골유도성이 뛰어난 물질로 평가된다(24). 특히 OCP에서 방출되는 Ca²⁺와 PO₄^3- 이온은 스캐폴드 표면에서 HA 재광화를 유도할 뿐만 아니라, 주변 세포 미세환경의 이온 농도와 pH를 조절함으로써 골모세포의 증식 및 분화를 촉진하는 것으로 보고되어 왔다(22, 24). 형성된 HA층은 세포 부착 단백질과 인테그린 수용체의 결합을 매개하여 세포-기질 상호작용을 강화하고, 이에 따라 MAPK, Wnt/β-catenin 등 골형성과 관련된 신호전달 경로가 활성화되는 것으로 알려져 있다(24, 25). 이러한 이온 방출-재광화-신호전달의 연속적인 과정은 단순히 기계적 지지체로서의 역할을 넘어, 스캐폴드 자체가 골조직 재생을 유도하는 생체활성 플랫폼으로 기능할 수 있음을 시사한다. 따라서 젤라틴 매트릭스 내에 OCP를 도입하는 것은, 유기 매트릭스가 제공하는 세포친화적 환경 위에 OCP의 이온 방출과 HA 전환을 결합하여 구조적 안정성과 골유도성을 동시에 확보할 수 있는 효과적인 전략으로 볼 수 있다.

최근 여러 연구에서 OCP와 젤라틴을 복합화한 스캐폴드의 생체활성이 보고되었다. Ezoe 등(26)은 젤라틴 매트릭스에 침적된 OCP 결정이 부분적으로 수화, 재결정화되면서 HA로 전환되고, 표면에 형성된 HA층이 세포 부착과 무기질화를 촉진함을 확인하였다. Handa 등(27)은 OCP/젤라틴 복합체를 제조하여 쥐의 두개골 결손 모델에 적용하였으며, 우수한 골전도성과 골유도성을 입증하였다. 또한 Kim 등(28)은 젤라틴/HA 복합체를 3D 프린팅 공정으로 제작하고, 무기상 함량 증가에 따라 기계적 강도와 세포 반응이 향상된다고 보고하였다. 그러나 이러한 연구들은 주로 단일 조성 또는 특정 제조 조건에서의 물성 및 생체활성 평가에 초점을 두었으며, OCP 함량 변화에 따른 구조적 안정성, 분해 거동, 재광화, 그리고 세포 반응을 통합적으로 비교·분석한 연구는 부족하다. 또한, 많은 젤라틴 기반 복합체들이 화학적 가교제에 의존하여 잔류 독성 및 공정 복잡성의 한계를 가진다(12, 13). 이에 반해 탈수열 처리는 별도의 화학 첨가제 없이 젤라틴 분자 간 에스터 결합을 형성하여 열적·기계적 안정성을 향상시킬 수 있는 친환경적 물리적 가교법으로 주목받고 있다(10, 11). 그러나 탈수열처리를 OCP/젤라틴 복합체에 적용하여 OCP 함량 변화가 미세구조, 분해 거동, 무기질화, 세포 반응에 미치는 영향을 체계적으로 규명한 연구는 보고된 바 없다.

따라서 본 연구의 목적은 탈수열 처리를 이용하여 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드를 제조하고, OCP 함량 변화에 따른 구조적 안정성, 분해 거동, 생체활성 및 세포 반응의 상관관계를 체계적이고 정량적으로 확인하고자 한다. 특히, 추가적인 화학적 가교제를 사용하지 않고 탈수열 처리를 통해 스캐폴드의 안정화를 유도함으로써, 화학적 잔류물 없이 열적 안정성, 기계적 강도 및 생체적 기능성을 확보할 수 있는 단순하고 친환경적인 공정을 제시하고자 하였다. 이러한 무기-유기 복합화 및 물리적 가교 기반 접근법은 젤라틴 기반 스캐폴드의 고질적 한계(빠른 분해, 낮은 강도, 잔류 화학물 문제)를 극복하기 위한 전략으로, 기존 젤라틴 또는 HA 복합체 연구와 차별화된 새로운 골재생용 바이오 스캐폴드 설계 방향을 제안한다. 연구의 가설은 다음과 같다. 1) 탈수열 처리가 적용된 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 젤라틴 단독 스캐폴드에 비해 열적·기계적 구조적 안정성이 유의하게 향상될 것이다. 2) OCP 함량이 증가할수록 스캐폴드의 하이드록시아파타이트 재광화를 촉진하고, 이에 따라 세포 부착 및 증식이 향상됨으로써 우수한 세포친화성을 나타낼 것이다.

재료 및 방법

2. OCP 합성 및 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드 제작

NaH₂PO₄·2H₂O와 (CH₃COO)₂Ca·H₂O를 각각 증류수에 용해하여 0.04 M 농도의 전구체 용액을 제조하였다. 이후 NaH₂PO₄ 용액에 (CH₃ COO)₂Ca·H₂O 용액을 25 mL/min의 속도로 천천히 떨어뜨리면서, 반응 용액의 pH를 암모니아수를 이용해 6.5로 유지하였다. 해당 반응은 70–80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응이 완료된 후 생성된 침전물은 0.2 μm 멤브레인 필터(Nalgene™ Rapid-Flow™, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA)를 이용하여 여과 및 증류수로 세척하였으며, 이 과정을 총 4회 반복하였다. 회수된 침전물은 37℃에서 3일간 건조한 뒤 분쇄하고, 체분리 과정을 통해 75–200 μm 입경의 OCP 분말을 얻었다.

합성된 OCP는 초음파기에서 1시간 동안 분산시킨 후 사용하였다. 젤라틴은 40℃로 가열된 멸균 증류수에 넣고 1시간 동안 교반하여 완전히 용해시켰으며, 이후 분산된 OCP를 첨가하여 OCP:젤라틴의 중량비를 각각 0:1 (0 wt% : 3 wt%), 0.5:1 (1.5 wt% : 3 wt%), 1:1 (3 wt% : 3 wt%), 2:1 (6 wt% : 3 wt%), 4:1 (12 wt% : 3 wt%)로 혼합하였다 (Figure 1). 혼합된 OCP/젤라틴 용액은 폴리스티렌 몰드에 주입한 후, 동결건조기 (FD8508, IlShin Lab Co., Yangju, Korea)에서 -80℃로 동결 건조하여 직경 6 mm, 두께 10 mm의 원기둥 형태 다공성 스캐폴드를 형성하였다. 이후 스캐폴드는 진공 오븐 (OV-11, JEIO TECH Co., Daejeon, Korea)에서 0.05 bar, 145℃, 48시간 동안 탈수열처리 (dehydrothermal treatment; DHT treatment)를 시행하였다. 최종적으로 완성된 스캐폴드는 Figure 1에서 확인할 수 있다.

Figure 1.

Classification and representative images of scaffold groups according to OCP/gelatin ratio and dehydrothermal treatment (0.05 bar, 145℃, 48 h). 'N' indicates untreated, and 'T' indicates the dehydrothermal-treated group.

결 과

1. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 특성

1.1. XRD 분석

본 연구에서 제작된 시료들의 XRD 분석 결과(Figure 2A), 0T그룹에서는 2θ≈20° 부근의 광범위한 피크만이 관찰되었다. OCP를 포함한 그룹들 (0.5T, 1T, 2T, 4T)에서는 OCP 구조와 일치하는 피크들을 포함하고 있으며, 열처리 후 OCP 피크의 일부 강도가 감소하고 4.7°에서 5.3°으로 피크 위치 및 폭이 변화하였다. 또한, 33.6°에서 HA 피크가 형성되었다.

Figure 2.

(A) XRD patterns and (B) FTIR spectra of OCP/gelatin composite scaffolds.

1.2. FTIR 분석

FTIR 분석(Figure 2B)에서는 젤라틴의 아미드 I(1650-1660 cm^⁻1), 아미드 II(1540-1560 cm^⁻1), 아미드 III(1200-1300 cm^⁻1) 밴드가 모든 그룹들에서 확인되었다. 0T 그룹은 젤라틴의 특유한 단백질 결합 구조를 반영하는 명확한 아미드 피크들이 관찰되었다. 한편, OCP 포함 그룹들(0.5T, 1T, 2T, 4T)에서는 PO₄^3- 진동 피크(1020-1100 cm^⁻1) 및 고결정화된 OCP 구조 피크(550-600 cm^⁻1)의 강도가 증가하였다. 0.5T, 1T 그룹들에서는 아미드 피크 강도가 감소하였고, 2T, 4T 그룹들에서는 젤라틴의 일부 아미드 결합이 안정화되었다. 또한, OCP 함유 그룹들은 OCP 단독 시료와 유사한 스펙트럼 패턴이 관찰되었다.

1.3. TGA/DTG 분석

TGA/DTG 분석에서 0T 그룹은 100-150℃에서 수분 증발에 따른 무게 감소가 있었고, 300℃ 이후 급격한 분해를 보였다(Figure 3A, 3B). 반면, OCP 함량이 증가할수록 무게 감소가 완만해졌고, 잔류량이 증가하였다(Figure 3A). DTG 곡선에서는 최대 분해속도 피크의 크기와 기울기가 OCP 함량 증가에 따라 감소하였다(Figure 3B). DSC 분석에서 0T 그룹은 150-300℃ 구간에서 비교적 뚜렷한 흡열·발열 반응을 나타낸 반면, OCP 함량이 증가할수록 이 구간의 반응이 거의 사라져 열전이 및 구조변화가 억제되었음을 나타내었다(Figure 3C).

Figure 3.

Simultaneous DSC–TGA curves. (A) TGA, (B) DTG, and (C) DSC of OCP/gelatin composite scaffolds.

2. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 형태 관찰

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 마이크로 기공을 갖는 다공성 구조로 제작되었으며, OCP 함량 증가에 따라 스캐폴드의 기공률과 기공 연결성이 동반 증가하였다(Figure 4). SEM으로 관찰한 내부 형태에서는 (Figure 4B), 0T 그룹에서 기공이 비교적 작은 구형을 이루며, 기공벽이 얇고 매끄러운 형태를 나타냈다. 반면, 4T 그룹으로 갈수록 기공이 커지고 상호연결성이 뚜렷해졌으며, OCP 입자가 젤라틴 사슬 사이에 물리적 지지체로 작용하면서 기공벽이 두꺼워지고 내부 표면에 무기상 입자들이 다수 분포되어 있는 것을 확인하였다. 확대된 기공벽 표면을 관찰한 결과, OCP가 포함된 그룹들에서는 벽체 표면에 미세한 무기결정들이 층상 또는 입상 형태로 균일하게 분산되어 있었다.

Figure 4.

Porosity and internal structure of OCP/gelatin composite scaffolds. (A) Porosity and (B) SEM images of the pores (300×) and pore walls (3,000×). Data are presented as mean ± SD (n=5). Different lowercase letters indicate significant differences between groups (p<0.05).

3. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 기계적 특성

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 압축강도와 탄성계수는 구조적 안정성을 평가하기 위해 측정되었다(Figure 5). OCP 함량 증가는 스캐폴드의 하중 지지 능력을 단계적으로 강화하였다. 특히 고함량 OCP 그룹(4T)은 젤라틴 단독 스캐폴드(0T)에 비해 약 5배 증가된 압축강도를 나타내었다.

Figure 5.

Mechanical analysis of OCP/gelatin composite scaffolds (A) Stress-strain curves and (B) compressive modulus (KPa) of OCP/gelatin composite scaffolds. Data are presented as mean ± SD (n=5). Different lowercase letters indicate significant differences between groups (p<0.05).

4. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 분해거동

본 연구에서 제작된 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 분해 거동 및 안정성을 연구하기 위해 분해 비율, 방출된 칼슘의 누적량, ΔpH, 팽윤율을 28일간 측정하였다(Figure 6). OCP 함량이 증가함에 따라 스캐폴드는 초기 급격한 질량 손실 없이 보다 완만한 분해 양상을 보였으며, 28일 동안 낮은 분해율을 유지하는 경향을 나타냈다(Figure 6A, 6B). 팽윤율(Figure 6E)은 0T 그룹에서 가장 높았으며, OCP 함량이 증가함에 따라 점차 감소하였다. 방출된 칼슘의 누적량은 OCP 함량이 많은 그룹에서 증가하였으며 (Figure 6C), pH 변화(Figure 6D)는 모든 그룹에서 초기에 소폭 상승한 뒤 평형을 이루었으며, OCP 고함량군일수록 약간의 알칼리화 경향을 보였다.

Figure 6.

Degradation behavior conducted in vitro. (A) Degradation ratio, (B) degraded samples, (C) cumulative amount of calcium release, (D) Δ pH, and (E) swelling ratio of OCP/gelatin composite scaffolds for different times. The mean and standard deviation values of the data are shown (n=5).

5. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 생물학적 활성 평가

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 생체활성을 평가하기 위해 SBF에 14일간 침적시킨 후 표면 형태 변화를 FE-SEM과 XRD로 분석하였다(Figure 7). FE-SEM 관찰 결과(Figure 7B-F), 0T 그룹에서는 부분적으로 HA 결정층이 관찰되었고, 0.5T 및 1T 그룹에서는 HA 결정층이 촘촘하게 형성되었다. 2T 및 4T 그룹에서 꽃잎(petal)-모양의 균일한 HA 결정층이 위로 성장하며 그 양이 증가하였다. 또한, XRD 분석(Figure 7A) 결과에서 HA 피크가 새롭게 분석되었으며, OCP 특유의 (100) 및 (700) 피크가 감소하였다. 특히 4T 그룹에서 HA 피크가 가장 뚜렷하게 관찰되었다.

Figure 7.

Surface analysis after 14 days of immersion in SBF solution. (A) XRD patterns and surface morphology observations of the (B) 0T, (C) 0.5T, (D) 1T, (E) 2T, and (F) 4T groups (20,000×).

6. OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 세포 증식 및 형태 관찰

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 세포 친화성을 평가하기 위해 MC3T3-E1 전조골세포를 이용하여 세포 증식과 세포 침투에 적합한 미세환경 형성을 확인하였다(Figure 8). WST-8 분석 결과, 모든 그룹에서 배양 7일차까지 세포가 지속적으로 증식하였으며 (Figure 8A), OCP 함량이 증가할수록 세포 증식률이 유의하게 증가하였다(p<0.05). 특히 4T 그룹은 7일차에서 0T 그룹보다 약 1.8배 높은 세포 증식률을 보였다.

Figure 8.

In vitro testing of MC3T3-E1 osteoblasts cultured on OCP/gelatin composite scaffolds. (A) Cell proliferation using WST-8 assay and cell morphology (Highlighted in blue) attached to (B) 0T, (C) 0.5T, (D) 1T, (E) 2T, and (F) 4T scaffolds (1,000x). Data are presented as mean ± SD (n=5). Different lowercase letters indicate significant differences between groups (p<0.05).

SEM 관찰 결과(Figure 8B–F), 모든 그룹에서 세포들은 분지된 방추형 형태로 스캐폴드 표면에 잘 부착·확장되어 있었으며, OCP를 포함한 그룹에서는 특히 기공벽을 따라 더 넓게 확장된 모습이 관찰되었다.

고 찰

이 연구에서는 OCP 함량 변화(0T; 0 wt%, 0.5T; 0.5 wt%, 1T; 1 wt%, 2T; 2 wt%, 4T; 4 wt%)에 따른 젤라틴 기반 복합 스캐폴드의 물리화학적 및 생물학적 특성 비교 연구가 수행되었다. 스캐폴드는 젤라틴 용액에 OCP를 각각의 비율로 혼합한 후, 탈수열처리(145℃, 48 h)를 통해 가교화 및 구조적 안정화를 유도하였다. 제조된 스캐폴드는 XRD, FTIR, TGA/DTG/DSC 분석을 통해 결정구조 및 열적 거동을 평가하였으며, SEM 관찰을 통해 기공의 구조와 형상을 분석하였다. 또한, 압축강도 측정을 통해 기계적 특성을 평가하였고, SBF 침적 실험을 통해 생체활성 및 HA 형성능을 검토하였다. 마지막으로, MC3T3-E1 전조골세포를 이용하여 세포 증식 및 부착 특성을 분석함으로써, OCP 함량 변화가 스캐폴드의 구조적 안정성, 열적 거동, 생체활성 및 세포친화성에 미치는 영향을 종합적으로 규명하였다.

스캐폴드의 특성 관찰 결과 OCP 피크의 감소 및 HA 피크의 형성은 열처리 과정에서 OCP의 수화층 탈수 또는 가수분해가 진행되었음을 시사한다. 이는 OCP가 열이나 수중 조건 하에서 부분적으로 HA로 전환될 수 있다는 보고와 일치한다(26, 27). 0.5T, 1T 그룹들에서는 OCP의 인산기(PO₄^3-)와 젤라틴의 아미드 결합(N–H, C=O) 간의 수소 결합 형성으로 인해 기존의 젤라틴 구조가 부분적으로 변화하면서 아미드 피크 강도가 감소하였다(28). 2T, 4T 그룹들에서는 OCP 함량이 충분히 증가하면서 OCP와의 결합이 네트워크 구조를 형성하여 젤라틴의 일부 아미드 결합이 안정화되었다(6). 또한, OCP 함유 그룹들은 OCP 단독 시료와 유사한 스펙트럼 패턴이 관찰되었으며, 이는 높은 OCP 함량이 젤라틴 매트릭스 내에서 안정적으로 존재하고 있음을 의미한다. 열분석 결과에서도 이러한 경향이 뒷받침된다. 열거동은 OCP가 젤라틴 사슬의 운동성을 억제하고, 무기상 네트워크가 열적 분해를 지연시키는 지지체 역할을 한 결과로 해석된다(18, 31). 따라서, 열처리에 의해 젤라틴의 2차 구조(α-helix, β-sheet)가 부분적으로 재배열되고(15), OCP의 함량이 증가하면서 구조적 지지 역할을 수행하여 아미드 피크 강도가 다시 증가하는 경향을 보였다. 본 연구에서 제작된 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 OCP의 결정구조 유지 및 젤라틴과의 상호작용을 통해, 고함량일수록 무기질화된 구조로 진입하여 생체재료로서의 잠재력을 갖춘다.

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 OCP 함량 증가에 따라 스캐폴드의 기공률과 기공 연결성이 동반 증가하여, 세포 침투와 영양분 확산에 보다 유리한 3차원 미세환경이 형성되었다. 이러한 기공률의 증가는 OCP 입자가 동결건조 과정 중 얼음결정 성장 및 제거 단계에서 핵(nucleation) 역할을 수행하여, 더 많은 기공과 상호연결 통로를 형성한 결과로 판단된다. 이는 무기입자가 젤라틴 매트릭스 내에서 얼음결정 성장을 방해하고, 그 결과 기공 구조를 미세조절할 수 있다는 기존 보고와 일치한다(32). 또한, 젤라틴-칼슘인산염 복합체에서 무기상 함량이 증가할수록 기공 크기와 연결성이 향상된다는 보고가 있다(33). OCP가 포함된 그룹들에서는 벽체 표면에 미세한 무기결정들이 층상 또는 입상 형태로 균일하게 분산되어 있으며, 이는 무기상-유기상 간 상호침투 구조가 형성된 증거로 해석된다. Wu 등(34)은 젤라틴-스트론튬 치환 칼슘인산염 복합체에서 기공 크기 및 벽체 두께가 무기상 함량 변화에 따라 유의하게 바뀌었음을 보고한 바 있다. 이러한 스캐폴드의 구조는 기계적 강도 향상뿐 아니라 세포 침투와 영양분 확산에 유리한 미세환경을 제공할 것으로 기대된다. 고함량 OCP 그룹(4T)은 젤라틴 단독 스캐폴드(0T)에 비해 약 5배 수준의 압축강도를 나타내어, 무기상이 기계적 지지체로 작용함을 보여준다. 이는 젤라틴/HA 또는 젤라틴–CaP 복합체에서 보고된 약 5–50 kPa 수준의 압축계수와 유사하거나 그 상한에 가까운 값으로(19, 28, 35, 36), 본 스캐폴드가 골조직공학용 지지체로서 요구되는 하중 지지 능력을 충족함을 나타낸다. 이러한 강화 효과는 SEM에서 관찰된 두꺼워진 기공벽과 균일한 무기상 분포(Figure 4B)와 직접적으로 연관되며, OCP 입자가 변형 과정에서 응력을 분산시키고 젤라틴 매트릭스의 국소 변형을 제어하는 역할을 한 것으로 보인다. Tavoni 등(35)은 칼슘인산염 기반 복합체에서 무기상 네트워크가 응력 분산과 미세균열 억제에 기여한다고 보고하였으며, Furkó 등(19)도 젤라틴-하이드록시아파타이트 복합체의 TGA 및 DTA 분석을 통해, 무기상 첨가가 젤라틴의 열분해 온도를 높이고 열적 안정성을 향상시켜 기계적 변형 저항성을 강화한다고 하였다. 본 연구에서도 DHT 처리 후 젤라틴의 2차 구조가 α-helix 및 β-sheet 형태로 부분적으로 재배열되면서 OCP–젤라틴 간 상호결합이 강화된 것으로 확인되었다. 따라서, OCP 함량 증가와 열처리에 따른 구조적 안정화가 복합체의 응력 분산과 하중 전달 효율을 향상시킨 것으로 판단된다.

본 연구에서 제작된 스캐폴드의 분해 거동 및 안정성은 젤라틴/HA 또는 젤라틴-CaP 스캐폴드에서 보고된 60-100%의 분해율 범위와 유사하거나 다소 낮은 수준에 해당한다(28, 36, 37). 이는 젤라틴 사슬 사이에 형성된 무기상 네트워크가 가수분해에 의한 급격한 구조 붕괴를 억제하고, 기공벽을 기계적으로 지지함으로써 구조적 안정성을 부여한 결과로 해석된다. 0T 그룹은 친수성 아미노기(-NH₂ )와 카르복실기(-COOH)에 의해 수분 흡수량이 많고, 수소결합 네트워크가 팽윤 시 쉽게 이완되지만, OCP가 첨가되면 젤라틴 사슬 사이에 무기상 결합이 형성되어 수분 확산이 억제된다. 이러한 경향은 Kim 등(28)과 Lantigua 등(36)의 연구 결과와 일치하며, 두 연구 모두 무기상(하이드록시아파타이트 또는 천연 골분 입자)이 젤라틴 기반 복합체의 수분 흡수와 팽윤 거동을 억제함으로써 기계적 및 열적 안정성을 높인다고 보고하였다. 방출된 칼슘의 누적량은 OCP 함량이 많은 그룹에서 증가하였고, 이는 OCP 입자에서 용출된 이온이 용액 내에서 재결정화를 유도하여 스캐폴드 표면에 HA 층을 형성했기 때문으로 해석된다. 이때 이온 방출 평가는 OCP의 수화 및 HA 형성 거동과 직접적으로 연관된 Ca²⁺를 대표 지표로 하여 수행하였다. 이러한 “이온 방출-재광화(ion release-remineralization)” 메커니즘은 Tajvar 등(37)이 보고한 생체활성 스캐폴드의 장기 안정성 향상 원리와 일치한다. 또한, 모든 그룹에서 28일 후 pH 평형을 이루었다. 종합적으로, OCP 함량 증가에 따라 젤라틴 네트워크는 수분 흡수에 대한 저항성이 높아지고, 완만한 분해 속도를 유지하면서 동시에 재광화 능력을 가지는 균형 잡힌 분해 특성을 갖추는 복합적 거동을 보였다.

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드에 형성된 꽃잎(petal)-모양의 균일한 HA 결정층은 Ca²⁺ 및 PO₄^3- 이온이 SBF 내에서 확산, 재결정화되며 스캐폴드 표면의 CaP 핵생성 사이트(nucleation site)를 통해 형성된 결과로 해석된다. Suzuki 등(25)이 보고한 바와 같이 OCP 표면 특성이 HA 결정의 핵형성과 성장에 직접 영향을 미친다는 결과와 일치한다. 또한, XRD에서 HA 피크가 새롭게 분석되었으며, 이러한 피크 전이는 OCP가 수화 및 재결정화 과정을 거쳐 HA 구조로 변환된 것을 의미한다. 특히 4T 그룹에서 HA 피크가 가장 뚜렷하게 관찰되어 OCP 함량이 높을수록 HA 형성이 촉진되었음을 보여준다. Handa 등(27)이 보고한 ‘OCP 가수분해 → HA 전이’ 경향과 일치한다. 젤라틴-HA 복합체에서는 주로 미리 형성된 HA 입자가 기계적 지지와 한정적인 이온 공급원을 제공하는 반면(16, 19, 28), 본 연구의 OCP/젤라틴 스캐폴드에서는 DHT 처리 과정에서 OCP가 부분적으로 수화·재결정화되며 HA로 전환되고, 남아 있는 OCP는 장기간에 걸쳐 Ca²⁺/PO₄^3- 이온을 지속적으로 방출한다(24, 25). 이러한 이온 방출은 표면 HA층의 재형성과 재광화를 반복적으로 유도하여, 스캐폴드 표면의 생체활성을 장기간 유지시키는 역할을 한다. SBF 침적 실험 결과는 OCP 표면의 Ca²⁺/PO₄^3- 이온 공급과 젤라틴의 친수성 작용기가 상호작용하여 생체 내 HA 성장을 유도할 수 있는 ‘self-mineralizing scaffold’로 작용함으로써 스캐폴드의 생체활성 및 세포 친화성 향상에 기여한다.

OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 젤라틴 단독 스캐폴드에 비해 전조골세포 성장에 더 유리한 미세환경을 제공하였다. 이는 OCP로부터 지속적으로 방출되는 Ca²⁺ 및 PO₄^3- 이온이 세포 외 기질(extracellular matrix) 내 인테그린 매개 신호전달을 촉진하고, 젤라틴 매트릭스의 생체모사적 특성이 fibronectin, vinculin 등의 세포 부착 단백질 흡착을 용이하게 하였기 때문으로 해석된다. Wu 등(16)의 보고와 마찬가지로, CaP 입자의 함량과 표면 거칠기는 세포 성장에 직접적인 영향을 미치는 중요한 인자로 작용하였다. SEM에서 확인된 세포들은 스캐폴드의 기공으로 부착되어 있었으며, OCP를 포함한 그룹에서는 기공벽을 따라 더 넓게 확장되었다. 세포 수준에서의 반응 기전을 고려하면, OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 1) OCP에서 방출되는 Ca²⁺ 및 PO₄^3- 이온에 의한 국소 이온 농도 조절과, 2) DHT 처리를 통해 안정화된 젤라틴–CaP 표면에 의한 세포-기질 상호작용 증대를 통해 전조골세포 반응을 유도한 것으로 판단된다. Ca²⁺ 농도의 상승은 integrin-FAK-MAPK 경로를 활성화하여 세포 부착과 증식을 촉진하고, osteogenic 관련 유전자 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있으며(16, 17, 20), 표면에 형성된 HA층과 OCP 잔존상이 제공하는 인산칼슘 기반 미세환경은 Wnt/β-catenin 신호전달 경로를 자극하여 ALP, OPN, OCN 등의 발현 증가와 연관된 골분화 과정을 촉진하는 것으로 보고되어 있다(38, 39). 특히 2T 및 4T 그룹에서는 세포들이 서로 연결된 세포망(cell network)을 형성하고 있었으며, 다수의 세포돌기(filopodia)와 라멜리포디아(lamellipodia)가 관찰되었다. 이는 OCP 입자의 미세 표면 거칠기와 스캐폴드 표면에 형성된 HA층이 세포 부착 및 세포골격 재구성을 촉진한다는 선행 연구 결과와도 일치한다(17). 또한 세포 성장과 스캐폴드 분해 속도 간의 균형 측면에서, 0T 그룹은 빠른 수분 흡수 및 분해로 장기 배양 시 세포 지지력이 감소하였으나, OCP 함량이 증가한 그룹들에서는 낮은 팽윤율과 완만한 분해 거동으로 세포 지지성이 유지되었다. 이는 무기상 함량 증가가 팽윤율을 감소시키고 세포 생존율을 향상시킨다는 Faruq 등(20)의 보고와 일치하는 결과이다. 결과적으로, OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 높은 세포 부착성, 안정적인 증식 능력, 그리고 HA 표면에 의한 세포-기질 상호작용 향상을 동시에 보여주었다. 이는 OCP가 제공하는 무기이온 방출에 의한 생화학적 신호와 젤라틴 매트릭스의 생체모사적 특성이 상호 보완적으로 작용한 결과이다.

본 연구의 독창성은 다음과 같이 요약할 수 있다. 첫째, 기존 젤라틴-칼슘인산염(CaP) 복합체 연구들이 주로 글루타르알데히드, EDC/NHS 등의 화학적 가교제나 3D 프린팅과 같은 복합 공정을 통해 스캐폴드의 안정성을 확보한 것과 달리, 본 연구는 탈수열 처리만을 이용하여 젤라틴 기반 스캐폴드의 구조적 안정성과 생체활성을 동시에 향상시켰다는 점에서 차별성을 가진다. 둘째, OCP 함량을 단일 조성에 한정하지 않고 단계적으로 조절함으로써, 하나의 플랫폼 내에서 OCP 비율 변화가 열적 안정성, 기계적 특성, 분해 거동, 재광화 능력, 세포 반응에 미치는 영향을 정량적으로 분석하였다. 셋째, OCP의 수화·재결정화에 따른 HA 형성, 이에 동반되는 열적 안정성 증가와 기계적 강화, Ca²⁺ 이온 방출 양상, 그리고 세포 부착 및 증식 반응을 서로 연계된 현상으로 통합적으로 논의함으로써, 단순한 재료 조합을 넘어 DHT 기반 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 설계 전략을 제시하였다. 이러한 점에서 본 연구는 젤라틴-CaP 계열 스캐폴드의 기존 한계(낮은 기계적 안정성, 빠른 분해, 화학적 가교제 잔류 문제)를 완화할 수 있는 대안점을 제공한다.

그러나 본 연구에는 몇 가지 한계가 존재한다. 첫째, in vitro 세포 실험은 상대적으로 단기 배양 조건에서 수행되었으며, WST-8 기반 세포 증식과 형태 관찰에 초점을 두고 있어 ALP, OPN, OCN과 같은 osteogenic marker의 발현 변화까지는 포함하지 못하였다. 따라서 본 연구는 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드의 구조적 안정성, 분해 및 재광화 거동, 초기 세포 부착·증식 반응을 규명한 기초 연구로 보는 것이 타당하다. 둘째, 스캐폴드의 골형성 능력은 in vitro 환경에서 간접적으로 추론하였을 뿐, 실제 골결손 동물모델에서의 장기적인 골재생 효율과 스캐폴드 분해 양상은 아직 평가되지 않았다. 향후 연구에서는 동일한 OCP/젤라틴 스캐폴드를 대상으로 장기 배양 조건에서 ALP 활성을 포함한 osteogenic marker 발현을 정량 분석하고, 전임상 동물모델에서의 골형성 및 스캐폴드 리모델링을 평가함으로써, 본 스캐폴드의 골재생용 바이오소재로서의 가능성을 보다 설득력 있게 검증할 필요가 있다.

마지막으로 임상적 관점에서 본 스캐폴드는 우선적으로 소·중등도 크기의 비하중 또는 저하중 골결손, 혹은 기존 골이식재와 병용하는 보조 스캐폴드로 적용하는 것이 적절할 것으로 판단된다. 반면, 대형 결손이나 장기간 고하중이 가해지는 부위에서의 장기 내구성과 체적 안정성은 아직 충분히 검증되지 않았으므로, 결손 크기와 위치, 환자의 골질 및 전신 상태를 고려하여 적용 범위를 신중히 설정할 필요가 있다.

결 론

본 연구는 젤라틴 기반 복합 스캐폴드의 조직공학적 활용을 위해, OCP 함량이 스캐폴드의 구조적 안정성, 분해 거동, 생체활성 및 세포 반응에 미치는 영향을 체계적으로 분석하였다. DHT 조건에서 제조된 OCP/젤라틴 스캐폴드는 젤라틴 네트워크 내에 무기상을 안정적으로 고정시켜 물리화학적 특성을 향상시켰으며, 추가적인 화학적 가교제가 필요하지 않음을 확인하였다. OCP 함량이 증가함에 따라 스캐폴드는 높은 결정 안정성과 향상된 기계적 강도를 보였으며, 열적 안정성 또한 개선되었다. 또한, 무기상 비율 증가는 젤라틴 사슬 간 수분 확산을 억제해 팽윤율과 분해 속도를 조절하였고, 동시에 OCP로부터 방출된 Ca²⁺와 PO₄^3- 이온은 표면에서 HA 재형성을 촉진하였다. 이러한 균형 잡힌 분해 및 재광화 거동은 스캐폴드가 생체 내 환경에서도 구조적 안정성을 유지하면서 세포 부착과 골 형성을 유도할 수 있음을 시사한다. 특히, OCP가 포함된 스캐폴드는 우수한 세포 증식과 부착 거동을 보였으며, OCP의 생체활성 표면과 젤라틴의 친수성 기능기가 시너지 효과를 발휘한 결과이다. 스캐폴드의 OCP 함량이 높을수록 세포 확산과 필로포디아 형성이 뚜렷하게 증가하여, 세포-기질 간 상호작용이 활성화됨을 확인하였다.

결론적으로, 본 연구는 OCP 함량을 조절함으로써 물리적 안정성과 생물학적 반응성을 동시에 제어할 수 있는 젤라틴 기반 하이브리드 스캐폴드를 제시하였다. 열적 가교 공정(DHT 처리)에 의해 얻어진 OCP/젤라틴 복합 스캐폴드는 화학적 잔류물이 없는 안정적인 구조와 우수한 생체활성을 갖추고 있으며, 향후 골조직 재생을 위한 3차원 바이오 스캐폴드로의 응용 가능성을 보여준다. 향후에는 본 스캐폴드를 소동물 두개골 결손 등 전임상 골결손 모델에 적용하여, in vivo에서의 장기 골형성 능력과 스캐폴드 분해 · 재광화 거동을 검증할 필요가 있다. 이 과정에서 결손 크기와 하중 조건을 반영한 기계적 안정성, OCP-HA 전환 및 이온 방출 특성을 종합적으로 평가함으로써, 임상 전단계 적용 가능성을 구체화할 수 있을 것으로 판단된다.

Acknowledgments

This research was supported by Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) funded by the Ministry of Education (No. 2022R1I1A1A01052952, RS-2024-00463725).

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