The effect of interconnective micropores of biphasic calcium phosphate scaffold on osteoblast cellular behavior

Ⅰ. 서 론

손상성 장애, 종양제거, 심한 골흡수 등으로 인해 골결손이 발생한 경우, 골결손부의 안정 및 치유를 증진시키기 위해 골 이식 술이 시행되고 있다. 골 이식술은 골 이식 재료의 종류에 따라 자가골 이식, 동종골 이식, 이종골 이식 그리고 합성골 이식 등 크게 4 가지로 분류한다. 이러한 골이식재 중 골유도성과 골형성능이 뛰어난 자가골은 가장 이상적인 골 이식재로 평가되지만, 자가골 채득을 위한 부가적인 수술이 필요하고 이로 인한 합병증과 회복기간의 증가, 많은 골이 필요한 경우 충분한 양을 얻을 수 없으며 채취에 부가적인 수술 시간이 더 소요되는 등의 단점이 있다 (Borstlap 등, 1990; Clavero와 Lundgren, 2003).

이러한 문제점을 극복하고 자가골을 대체하기 위한 다양한 종류의 골이식재의 개발과 연구가 지속되고 있다. 최근까지 많이 사용되고 있는 동종골 이식재는 사체에서 채취하므로 환자의 불편함이나 양의 부족 등의 문제는 극복할 수 있으나 조작이 쉽지 않고, 약 1백만에서 8백만 분에 1의 확률로 질병 감염의 가능성이 있다. 또한, 면역학적 거부현상을 감소시키기 위한 과정에서 골형성 능력이 감소되고 표본별로 골유도 능력에 상당한 차이를 보이는 단점이 있다 (Emmings, 1974; Froum 등, 1995; Wolff 등, 2000). 그리고 이종 골의 경우, 공급과 제조가 용이하지만 동물의 질병 전염 가능성 및 골 유도능이 상당히 떨어지는 단점을 지니고 있다 (Araújo 등, 2009).

최근에는 합성골 이식재에 관한 연구가 광범위하게 이루어지고 있으며, 전세계적으로 골재건 수술에서 사용되는 이식재의 상당부분을 합성골 이식재를 사용 하는 것으로 보고되었다 (Lewandrowski 등, 2000). 합성골 대체재로 가장 일반적으로 이용되는 세라믹 재료 중 인산칼슘 계 재료는 골조직과 치아의 성분 및 구조가 유사하며, 생체친화성을 가지고 있기 때문에 골 이식 재료로서 많은 연구가 이루어져 왔다 (Daculsi 등, 1990; Jarcho, 1981).

최근 가장 각광받는 인산칼슘 계 합성골 이식재인 hydroxyapatite (HA)와 beta-tricalcium phosphate (β-TCP)을 혼합한 biphasic calcium phosphate (BCP) 합성골 이식재에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. HA는 신생골이 성장할 수 있는 훌륭한 골격을 제공할 수 있으나 낮은 분해능으로 인해 재생능에 있어서는 평가가 회의적이었던 반면, β-TCP는 골결손부위에서 신생골 형성 능력이 있음이 증명되었으나 너무 높은 분해성으로 인해 신생골이 형성되기 이전에 모두 분해가 되어 지지체로서의 역할에는 한계가 있었다 (Daculsi 등, 1989; Gauthier 등, 1998; Karabuda 등, 2001). 따라서, BCP는 안정성 높은 재료인 HA와 생물학적 활성도가 높은 재료인 β-TCP를 적절히 혼합함으로써 합성골의 흡수와 신생골 형성 간에 완벽한 균형을 이룰 수 있을 것으로 생각된다 (Nery 등, 1992; Yamada 등, 1997). HA와 β-TCP의 최적의 혼합비율을 알아내고자 하는 연구에서, HA의 비율이 β-TCP의 비율보다 높은 것이 골결손 내에서 신생골 형성을 촉진한다고 밝혀졌다 (Nery 등, 1992). 일반적으로 60%의 HA와 40%의 β-TCP를 혼합하는 것이 골이식재로서 가장 이상적인 혼합비율이라고 주장하고 있다 (Daculsi, 1990; Nery 등, 1992).

구조적으로는 신생골과 혈관이 형성해 나갈 수 있고 세포들이 이동할 수 있는 거대기공과 그 기공들이 상호 연결성이 매우 중요하다. 아직까지 기공의 크기는 논란의 대상인데, Klawitter와 Hulbert (Klawitter와 Hulbert 등, 1998) 등은 효과적인 뼈의 성장이 이루어지려면 최소한 기공의 크기가 100 µm 이상이 되어야 한다고 주장하였으며 150 µm 일 때 최적이라고 제안하였다. 또한 Chung 등 (Chung 등, 2000)은 다양한 기공 크기를 가진 직선형 다공성 세라믹으로 실험한 결과 50μm 뼈의 성장이 일어났으며, 300 µm에서 가장 왕성한 골 성장이 나타났다고 보고하였다.

이에 부가적으로는 골이식재의 표면특성과 관련된 최근의 연구는 마이크론 단위의 미세다공성구조의 중요성을 강조하고 있다. 직경 10 µm이하의 미세기공은 이식재 내부로의 체액순환을 용이하게 하여 용해와 분해에 영향을 미치고 골재생 과정에서 단백질 흡착, 세포부착과 광물화를 촉진하여 골조직 재생을 향상하는 가장 중요한 표면특성의 하나인 것으로 알려졌다 (Gauthier 등, 1998; Fujibayashi 등, 2004).

본 연구에서는 미세기공에도 거대기공과 같이 상호 연결성이 형성이 된다면 더욱 증진된 결과를 얻을 수 있을 것 이라는 가정을 하고, 상호 연결된 거대 기공과 상호 연결된 미세기공을 함께 가진 스캐폴드를 제작하여 미세기공률에 따른 조골세포의 거동을 평가하였다.

재료 및 방법

표면 미세기공 형성

위와 같은 방법으로 소결된 시편을 BCP 분말과 2% PVA solution을 1:3의 비율로 혼합한 점도가 낮은 슬러리에 함침하고 압축공기를 분사하여 잉여 슬러리를 제거함으로써 슬러리를 2차적으로 코팅하였다. 상온에서 12시간 건조한 후, 3시간의 소결 과정을 거쳐 미세 기공이 표면에 형성된 스캐폴드를 제조하였다. 이때 소결온도 조건을 Table 1과 같이 1150°C, 1200°C로 각각 달리하여 미세기공을 조절하였다. 그리고 그에 따라 표면에 형성된 미세기공을 image analyzer로 분석한 결과 미세기공률이 각 조건 별로 5%, 20%를 나타내었고 이를 바탕으로 하여 실험군을 MP5와 MP20으로 명명 하였고, 2차적인 BCP코팅을 하지 않아 미세기공이 형성되지 않은 스캐폴드를 대조군으로 선정하였다.

Table 1.

Experimental groups and the different secondary coating condition

결 과

Figure 1은 주사전자현미경을 이용하여 스캐폴드 표면의 미세구조를 고배율로 관찰한 결과이다. 묽은 슬러리로 2차적인 코팅을 하지 않은 거대기공만 가진 스캐폴드의 표면은 미세기공이 전혀 존재하지 않은 치밀한 구조를 나타내고 있다 (Figure 1(a)). 반면에 2차적인 BCP 코팅을 수행한 스캐폴드는 Figure 1(b)와(c)에서 나타나듯이 미세기공이 형성 되는 것을 관찰 할 수 있었다. 그리고 MP5와 MP20을 비교해 보았을 때, MP20에서 훨씬 많은 미세기공을 관찰 할 수 있었고, 미세기공들이 상호 연결된 상호 연결성을 형성한 것을 관찰 할 수 있었다.

Figure 1.

SEM images of microstructure of scaffold (10,000×, bar 1 μm): (a) MP0; (b) MP5; (c) MP20.

Figure 2와 Table 2에서는 표면의 AFM 이미지와 중심선 평균 거칠기 (R_a) 그리고 표면적을 나타내었다.

Figure 2.

AFM images of microstructure of scaffold: (a) MP0; (b) MP5; (c) MP20.

Table 2.

Average surface roughness (Ra) and surface area

2차적인 코팅을 한 표면은 미세기공을 형성하면서 코팅을 하지 않은 표면보다 유의하게 큰 R_a값을 나타내었다 (p' > 0.05). 그리고 표면의 기공률이 증가할수록 R_a값은 증가하는 경향을 보였으며, 그에 따른 표면적도 증가하였다.

2차적인 코팅을 하지 않은 표면에서는 접촉각이 약 55°로 측정이 되었다. 5%의 미세기공이 형성 된 MP5는 9° 정도로 접촉각이 감소하였다. 그리고 micoporosity가 증가할수록 접촉각은 점점 더 감소하였다 (Figure 3). 이 결과로 표면에 존재하는 미세기공이 표면의 친수적인 성질을 향상시키는 것으로 확인되었다.

Figure 3.

Contact angle of MP0, MP5, and MP20.

Figure 4는 스캐폴드에서 1일 간 배양한 MG63 세포를 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다. 관찰 결과 미세기공이 없는 MP0에서는 세포가 둥근 형태를 유지하며 세포 퍼짐이 잘 일어나지 않은 형상을 나타내었다. 반면 미세기공이 형성된 스캐폴드인 MP5, MP20 에서는 세포들이 표면에 넓게 퍼져있는 것을 관찰 할 수 있었고, 퍼진 정도는 미세기공률이 증가할수록 증가하는 것을 관찰할 수 있었다.

세포증식률은 Figure 5의 결과와 같이, 배양 후 1일, 3일, 그리고 7일 3개의 시점에서 확인하였다. 결론적으로 미세기공이 형성된 시편이 미세기공이 형성되지 않은 시편보다 유의하게 높은 증식률을 나타내었고, 미세기공률이 증가할수록 증식률 또한 증가하는 것을 확인하였다.

Figure 4.

Morphology of MG63 cells cultured on MP0, MP5, and MP20 after 1 day of culture (1,000×, bar 10 μ m).

Figure 5.

Proliferation of MG63 cells cultured on MP0, MP5, and MP20. The same letter indicates no statistically significant difference.

고 찰

감염성 질환이나 외상, 임플란트 식립과 연관하여 잔존골량이 부족한 경우 결손된 골조직을 회복하기 위해 골이식술을 이용한 재건수술이 시행된다. 가장 이상적인 이식재인 자가골 이식재는 채득을 위한 부가적인 시술부위가 필요하며 이와 연관된 단점으로 인해 여러 종류의 골 대체재에 관해 많은 연구가 이루어져 왔다. 골유도능을 가지는 것으로 알려진 탈회동결건조골과 우골에서 단백질 성분을 제거한 이종골 이식재를 사용한 골재건 수술에서 성공적인 결과가 보고되고 있으나, 질병전염의 가능성을 전혀 배제할 수는 없다는 문제점을 가진다 (Schwartz 등, 1998). 골이식재와 관련된 최근의 연구는 이러한 문제점이 없는 합성골 이식재에 관해 광범위하게 진행되고 있는 추세이다. 골이식재의 골유도능과 관련된 일련의 연구에서 이식재가 이소성골형성 (ectopic bone formation)을 유도하기 위해서 화학적 조성 외에, 미세다공성의 표면구조 를 포함한 특정한 표면형태가 중요한 인자로 작용함이 제시되었다 (Yuan 등, 1998; Habibovic 등, 2005). 골형성과정에서 거대기공 구조의 중요성과 더불어 Yuan 등 (Yuan 등, 1999)은 거대기공 내면에 존재하는 미세기공이 인산칼슘계 세라믹의 골유도능에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 보고하였다. 현재까지 이식재의 골유도능에 관한 정확한 기전은 설명되지 않았지만 칼슘과 인을 함유하는 인산칼슘계 세라믹의 화학적 조성, 상술한 이식재의 미세다공성구조와 적절한 용해도가 이에 기여하는 것으로 여겨진다. 인산칼슘계 세라믹의 화학조성은 생체환경 내 존재하는 성장인자 등의 표면흡착을 조장하여 차후 표면에 부착된 골형성 전구세포들의 조골세포로의 분화를 촉진할 수 있는 것으로 제시되었고 (de Groot, 1998), 이식재 내면의 미세 다공성 표면구조 역시 골형성 과정에 영향을 미치는 성장인자 등의 흡착과 함입을 증가시켜 국소적인 부위에서 골형성에 영향을 미치는 특정수준까지의 골형성 인자들의 농도상승에 기여하는 것으로 알려졌다. 또한 타이타늄 임플란트에서의 연구에서와 같이 분화를 포함한 골형성세포의 반응이 이러한 미세구조에 영향을 받는 것은 잘 알려진 사실이다 (Marinucci 등, 2006; Sammons 등, 2005).

스캐폴드의 미세구조를 관찰하기 위하여 시행된 SEM관찰 결과, MP0에서는 미세기공이 전혀 형성되지 표면형상을 가진다. 이는 입자의 크기가 미세하고 높은 소결온도로 인하여 충분한 입자성장이 일어기 때문으로 보여진다. 이에 반해 MP5와 MP20 의 경우는 묽은 슬러리에 한번 더 코팅이 되면서 소결 과정 중 먼 입자간 거리 때문에 완전한 입자성장이 되지 않아 미세기공을 형성한 것을 확인할 수 있었다. 하지만 MP5는 MP20이 비하여 높은 소결온도에서 제작되었기 때문에 더 많은 입자성장이 일어나 미세기공이 훨씬 적게 나타났다.

스캐폴드의 표면 거칠기를 측정하기 위하여 수행한 AFM 분석 결과, 미세기공이 형성되지 않은 표면에서는 R_a값이 24.4 nm로 미세기공을 형성시킨 MP5와 MP20에 비하여 현저히 낮은 결과를 보였다. 이 결과를 통하여 미세기공형성이 표면에 거칠기를 부여한다는 결과를 얻을 수 있었다.

재료의 접촉각 실험 결과, 미세기공이 형성됨으로서 미세기공이 없는 표면보다 훨씬 더 친수성을 띤다는 결과를 얻을 수 있었다. 표면의 친수성은 단백질의 흡착, 세포의 증식 및 퍼짐에 매우 중요한 역할을 하는 인자이다.

MTT assay 결과 미세기공이 존재하는 스캐폴드에서 유의하게 높은 세포 증식을 나타내었으며, 미세기공률이 증가할수록 세포의 증식률은 더욱 높게 나타났다. 세포의 형상 역시 미세기공이 없는 표면에서는 퍼짐이 거의 일어나지 않은 둥근 형태를 띄고 있었지만, 미세기공이 형성된 표면에서는 세포가 표면에 넓게 퍼져있는 것을 관찰 할 수 있었고, 이 결과 역시 미세기공률이 증가 할수록 더 넓은 면적을 차지하며 퍼짐이 잘 일어난 것을 관찰 할 수 있었다.

결 론

본 연구에서는 sponge method로 제작한 BCP 거대 기공만 가지는 스캐폴드에 BCP 슬러리를 한층 더 코팅시킴으로써 상호연결된 미세기공층을 형성시켜 다음과 같은 결과를 얻었다.

1. 미세기공층이 형성된 스캐폴드의 거칠기가 미세기공이 없는 스캐폴드의 거칠기에 비하여 크게 증가하였다.

2. 미세기공이 없는 표면에서는 접촉각이 55° 정도였는데, 미세기공이 형성됨으로써 접촉각이 유의하게 낮아졌다 (p > 0.05).

3. 골아세포의 증식률과 퍼짐이 미세기공이 형성된 스캐폴드에서 더 잘 일어나는 경향을 보였다.

Acknowledgments

이 논문은 2013학년도 경북대학교 학술연구비에 의하여 연구되었음.

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